В 1859 году стал заведующим хирургическим отделением одесской городской больницы. В 1863 году стал доктором медицины. С 1866 года Склифосовский работал в Германии, в патологоанатомическом институте, военном лазарете, затем во Франции и Англии. Вернувшись в Россию, он издал множество трудов и был приглашен в Киевский университет на кафедру хирургии, где с 1870 года был профессором, а затем – Императорской медико-хирургической академии в Санкт-Петербурге. С 1880 года Склифосовский был профессором и деканом медицинского факультета Московского университета, в 1893-1900 годах возглавлял институт усовершенствования врачей в Петербурге. Он также работал в военных клиниках Черногории вместе с полевым хирургом Николаем Пироговым. Развивая взгляды Пирогова, Склифосовский внес значительный вклад в развитие военно-полевой хирургии. Именно Николай Васильевич способствовал внедрению в отечественную хирургию принципов антисептики и асептики. Он стал одним из пионеров полостной хирургии при оперативном лечении заболеваний желудка, печени, мочевого пузыря и женских болезней, разработал оригинальную операцию соединения костей при ложных суставах. Занимался Склифософский и просветительской деятельностью - он был соредактором журнала "Летопись хирургического общества" в Москве (с 1891), инициатором Пироговских съездов врачей, президентом 12-го Международный конгресса врачей в Москве (1897), учредителем и председателем 1-го съезда российских хирургов (1900). Склифософский пользовался большим авторитетом коллег и пациентов. Когда отмечалось 25-летие его профессиональной деятельности, он получил более 400 телеграмм и большое число писем из многих стран мира. Пережив инсульт, в последние годы жизни он поселился в своей усадьбе под Полтавой, занимался садоводством. (30 ноября) 13 декабря 1904 года Николай Васильевич Склифосовский скончался в селе Яковцы Полтавской губернии. Имя великого хирурга в 1923 году было присвоено Московскому научно-исследовательскому институту скорой помощи.