Родился 18 декабря 1921 года в Демидове (ныне Смоленской области). Отец, Владимир Андреевич (1898—1964), демобилизовавшись из Красной Армии и окончив курсы Политпросвета, устроился в драматический театр в Демидове. Там же была актрисой и его мать, Лидия Ивановна (1902—1979).
В 1925 году его семья перебралась в Москву. 8 ноября 1939 года был призван в армию, служил в 115-м зенитно-артиллерийском полку. Во время советско-финской войны зенитная батарея, где он служил, находилась под Сестрорецком и охраняла воздушные подступы к Ленинграду. В Великую Отечественную войну воевал под Ленинградом до 1943 года. Весной 1943 года заболел воспалением лёгких и был отправлен в ленинградский госпиталь, а сразу после выписки оказался контужен во время авианалёта на Ленинград. После выписки в августе 1943-го Никулин был направлен в 72-й отдельный зенитный дивизион под Колпино. Был демобилизован в мае 1946 года в звании старшего сержанта; за время войны был награждён медалями «За отвагу», «За оборону Ленинграда» и «За победу над Германией».
В 1949 окончил студию разговорных жанров при Московском цирке и стал там же выступать в жанре клоунады (в дуэте с М. Шуйдиным). Приобретя известность в цирковых интермедиях, в которых смешные репризы и пантомима сочетались с мастерским выполнением трюковых номеров, Никулин был в 1958 приглашен в кино, где в небольших ролях («Девушка с гитарой», «Неподдающиеся», «Друг мой, Колька!», «Без страха и упрека») первоначально повторял, по сути, цирковые приемы эксцентрики. Казалось бы, и знаменитая киномаска Балбеса (короткометражки Л. И. Гайдая «Пес Барбос и необычайный кросс» и «Самогонщики», 1961, а также его же комедии «Операция «Ы» и другие приключения Шурика», 1965; «Кавказская пленница», 1966), которая пользовалась невероятной зрительской популярностью, была создана по законам исключительно внешнего комизма.
Однако сыгранные тогда же вновь у Гайдая роли в фильмах «Деловые люди» (1963) и «Бриллиантовая рука» (1968) подтвердили, что Никулин склонен обнаруживать за маской комического героя по-своему страдательную натуру, а несколько простоватая физиономия не исключает наличия у ее обладателя подлинных человеческих чувств, порой весьма драматических переживаний. К счастью, актер уже успел в убедительной житейской драме «Когда деревья были большими» (1962) с блеском продемонстрировать несоответствие обманчивого облика сложному внутреннему естеству того, кто считается отверженным в обществе.
Способность к лиризму и трогательность в исполнении роли трудно перевоспитывающегося пьяницы Кузьмы Иорданова пригодилась Никулину в фильмах «Ко мне, Мухтар!» (1965), «Телеграмма» и «Двенадцать стульев» (1971), «Старики-разбойники» (1972), «Точка, точка, запятая...» (1973) и особенно «Чучело» (1984), в которых он создал образы простодушных, наивных, чудаковатых, но чрезвычайно добрых и отзывчивых героев. Природный трагикомизм таких персонажей, как монах Патрикей («Андрей Рублев», 1966, выпуск на экран — 1971) и солдат Некрасов («Они сражались за родину», 1975), из-за жестокости исторических событий, участниками которых они оказываются, поневоле приобретает подлинно драматический пафос.
Вершиной актерского мастерства Никулина в кино стала уникальная по достоверности, максимально сдержанная по манере и вместе с тем подспудно наполненная богатыми эмоциями роль журналиста Лопатина в ленте «Двадцать дней без войны» (1977) А. Ю. Германа. Став в 1982 главным режиссером и директором Цирка на Цветном бульваре, Никулин, к сожалению, практически перестал сниматься в кино, но часто появлялся на телевидении (особенно удавалась ему роль ведущего в передаче «Белый попугай»). Подкупающая искренность, неподдельная человеческая теплота, умение расцвечивать жизнь, тонкое чувство юмора снискали ему подлинно народную любовь.
14 ноября 1956 года в семье Никулиных родился сын Максим.
Юрий Владимирович Никулин скончался 21 августа 1997 после операции на сердце и похоронен на Новодевичьем кладбище
В 2000 в Москве рядом со зданием цирка на Цветном бульваре открыт памятник Юрию Никулину (скульптор Александр Рукавишников, архитектор Михаил Посохин).